download pdf lengkap Assessment of Gene Flow from Genetically Modified Anthra klik disini!!!

Assessment of Gene Flow from Genetically Modified Anthracnose-Resistant Chili Pepper (Capsicum annuum L.) to a Conventional Crop

Abstrak

Selama dua tahun ini (tahun 2006 dan tahun 2007), telah dilakukan pengkajian terhadap gene flow dari tanaman cabai transgenik (yang mengandung gen PepEST (pepper esterase)) ke tanaman cabai non-transgenik yaitu galur “WT15” sebagai kontrol, varietas “Manidda” dan “Cheongpung Myeongwol (CM)” yang merupakan varietas komersial. Benih yang didapatkan dari tanaman – tanaman tersebut kemudian diseleksi dengan menggunakan higromisin. Pengecekan terhadap keberadaan transgene dilakukan dengan melakukan PCR terhadap kecambah – kecambah yang resisten terhadap higromisin. Pada percobaan tahun 2006, didapatkan 8 hibrida dari 7071 benih WT15 dan 12 hibrida dari 6854 benih hibrid Manidda. Pada percobaan tahun 2007, dihasilkan 33 hibrida dari 3456 benih WT15 dan 50 hibrida dari 3457 benih CM. Frekuensi gene flow tertinggi dihasilkan dari percobaan 2007 yaitu sebesar 6,19%. Hasil tersebut menunjukan bahwa isolasi jarak akan dapat mencegah terjadinya gene flow dari tanaman transgenik ke tanaman non-transgenik.

 

Kata kunci: Cappsicum annum, Chilli pepper, Gene flow, Genetical modified crop

PENDAHULUAN

             Antraknosa dapat disebabkan oleh beberapa spesies Colletotrichum, yaitu C. gloeosporioides, C. capsici, dan C. coccodes. Antraknosa dianggap sebagai salah satu penyakit yang paling merusak tanaman cabai (Cappsicum annum L.). Antraknosa dapat menurunkan produksi buah cabai tahunan sebesar 13% di Korea (Yoon et al., 2004).

Ekspresi esterase gen yang diisolasi dari tanaman cabai berperan dalam antraknosa resisten pada buah cabai (Kim et al. 2001; Ko et al. 2005). Kim et al., (2006) mendapatkan tanaman cabai yang resisten terhadap antraknosa dengan cara mengintroduksi dan melakukan over – expressing PepEST gen.

Walaupun tanaman transgenik masih belum dilegalkan di Korea, namun kajian gene flow ini diharapkan akan dapat menjadi salah satu pondasi bagi perkembangan tanaman transgenik dikemudian hari. Semakin maraknya penelitian tanaman transgenik, menyebabkan kajian ini menjadi penting terkait pembuatan guidelines untuk pengujian lapang dan pengkajian kerusakan lingkungan tanaman transgenik sebelum suatu tanaman transgenik tersebut dikomersialkan.

Meksiko dan bagian utara dari Amerika tengah merupakan pusat keragaman genetik dari tanaman cabai (Heiser and Smith 1953;Pickersgill 1997; Perry et al. 2007). Cappsicum annum merupakan satu – satunya spesies Cappsicum yang dibudidayakan di Korea. Cabai merupakan tanaman menyerbuk sendiri sebagian (OECD 2006), namun seringkali terjadi penyerbukan silang alami yang tinggi diantara tanaman cabai  (Campodonico 1983; Tanksley 1984). Analisis gene flow yang dilakukan pleh Kim et al., (2009) melaporkan bahwa terdapat frekuensi penyerbukan silang alami yang tinggi yaitu sebesar 17,89% dari tanaman cabai transgenik yang mengeksprsikan coat protein gene (berasal dari Chucumber mosaic virus) ke tanaman cabai konvensional pada jarak pertanaman yang dekat. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi frekuensi gene flow dari tanaman cabai transgenik “antraknosa resisten” ke tanaman non-transgenik.

 

BAHAN DAN METODE

 Bahan Tanaman

Pada percobaan ini digunakan bahan tanam tanaman cabai antraknosa resisten (GM), galur WT512 sebagai kontrol, dan dua varietas hibrida komersial”Manidda dan “Cheongpung Myeongwol (CM)”. Tanaman cabai antraknosa resisten (GM) dihasilkan dari transformasi dengan media Agrobacterium tumefaciens (Kim et al., 2006). Tanaman GM memiliki konstak yang terdiri dari PepEST (CaMV) 35S promotor, nos terminator, dan hpt gene untuk seleksi higromisin.

 

Rancangan Percobaan

Percobaan ini dilakukan selama 2 tahun di lahan yang diisolasi di Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Cheongwon-gun, Chungcheongbukdo, Republic of Korea (36°43′04″ N, 127°26′07″ E, pada ketinggian 37 m)

Total curah hujan pada tahun 2006 dan 2007 adalah 835,1 dan 1320,3 mm. (Table 1; Korea Meteorological Administration 2009). Suhu rata – rata  adalah 15.4–26.9°C, sedangkan kelembabannya berkisar pada 56.8 – 80.4%. Kecepatan angin pada bulan Mei – Juli lebih cepat dibandingkan kecepatan angin pada bulan Agustus – Oktober.

Pada bulan Mei 2006, dibuat petakan seluas 5 m x 5 m sebagai blok pusat yang diapit oleh blok lagi seluas 5 m x 20 m di kanan dan kiri blok pusat (Gambar 1). Setiap blok terdiri dari 4 baris yang ditutupu oleh plastik film berwarna hitam. Pada blok pusat ditanami oleh 40 tanaman transgenik (antraknosa resisten) dengan jarak tanam dalam baris sebesar 50 cm, sedangkan pada dua plot yang mengapit blok pusat ditanami 80 cabai Manidda pada baris a dan b dan 80 cabai WT512 pada baris c dan d dengan jarak tanam dalam baris sebesar 50 cm. Jarak tanaman terdekat dengan blok pusat adalah 0,5 m, sedangkan jarak terjauhnya adalah 20 m. Budidaya tanaman – tanaman tersebut dilakukan secara konvensional. Insektisida diberikan untuk mengendalikan aphids dan Oriental tobacco budworm dari bulan Juni sampai bulan Agustus.

Percobaan pada tahun 2007 dilakukan pada bulan Mei juga. Percobaan ini lebih menekankan pada desain blok percobaan untuk menginvestigasi non-target effects dan ketahanan tanaman cabai transgenik yang ada. Setiap blok percobaan memiliki luas sebesar 7 m x 8 m dan terdiri dari 6 baris (Gambar 2). Dalam blok tersebut ditanami bibit cabai transgenik, WT512, dan hibrida CM sebanyak 114 tanaman yang telah berumur 7 minggu. Penyemprotan fungisida dan insektisida dilakukan pada bulan Juni.  Penyemprotan ini bertujuan unutk mengendalikan serangan Phytophthora blight dan aphids.

 

Tanaman Sampel

            Pada percobaan tahun 2006, dilakukan pemanenan buah yang sudah matang dari masing – masing galur sebanyak 10 buah per tanaman. Buah – buah yang sudah matang tersebut, kemudian di oven pada suhu 60°C selama 2 hari. Setelah itu, biji dipisahkan dari buahnya dan disimpan pada ruangan tertentu untuk dijadikan benih.

Pada percobaan tahun 2007, dilakukan pemanenan terhadap buah cabai yang sudah matang sebanyak 10 buah per tanaman. Pemanenan dilakukan secara acak pada setiap baris tanaman.

 

Seleksi Tanaman Hibrida

            Higomisin assay dengan konsentrasi 30 mg L−1 dilakukan untuk menyeleksi keberadaan tanaman hibrida transgenik. Benih – benih yang dianalisis adalah benih – benih  yang dipanen pada bulan Agustus dan September pada tahun 2006 dan 2007. Dua kertas saring autoklaf ditempatkan pada petridish. Dari setiap sampel diambil 100 benih. Benih – benih tersebut kemudian disterilisasi dengan 5% larutan sodium hipoklorit selama 10 menit, kemudian dibilas sebanyak 5 kali dengan air destilasi selama 5 menit. Setelah itu, benih – benih tersebut dilapisi dengan kertas saring dan ditanam pada media ½ MS yang ditambahkan dengan larutan 30 mgL-1 higromisin. Tanaman cabai transgenik dan WT512 digunakan sebagai tanaman kontrol.

Semua petridish tersebut kemudian diinkubasi dalam growth chamber (28°C, 70% relative humidity, and 16-h photoperiod) selama 2 minggu, setelah itu dilakukan perhitungan terhadap jumlah total benih yang sudah berkecambah. Kotiledon dan hipokotilnya diambil dari benih yang resisten terhadap higromisin, kemudian dihancurkan dengan PlantSaver™ FTA cards (Whatman, USA) untuk dianalisis DNA nya, lalu disimpan di dalam RT.

PCR dilakukan dengan menggunakan FTA cards. PCR tersebut menggunakan desain forward primer Hygro – 546F (GTG TCG TCC ATC ACA GTT T) dan reverse primer Hygro – 3R (GAA AAA GCC TGA ACT CAC C) untuk mengamplifikasi hpt gene. Sementara itu, untuk mengamplifikasi actin gen digunakan desain forward primer (TGG ACT CTG GTG ATG GTG TC) dan reverse primer (CCT CCA ATC CAA ACA CTG TA). Volume akhir yang digunakan untuk PCR sebanyak 0.5 μL yang mengandung 2 disk dari FTA cards, 0.5 μL of a 10 mM dNTP mixture, 0.5 μLof Taq DNA polymerase, 5 μL of 10× Taq buffer, and 2 μLof 10 pmol pada setiap primer. Suhu awal untuk denaturasi adalah 95°C selama 5 menit, kemudian digunakan 38 siklus dengan suhu denaturasi 94°C selama 1 menit, suhu annealing 55°C selama 30 detik, dan ekstension pada suhu 72°C selama 1 menit, yang diikuti dengan final ekstension pada suhu 72°C selama 5 menit.

PCR yang digunakan untuk tanaman sampel dari percobaan tahun 2007 adalah duplex PCR. Desain forward primer Hygro – 546F (GTG TCG TCC ATC ACA GTT T) dan reverse primer Hygro – 3R (GAA AAA GCC TGA ACT CAC C) digunakan untuk mengamplifikasi hpt gene, sedangkan untuk mengamplifikasi lipocalin digunakan desain forward primer 850U (GGT GAA CCT TGG AAC GAA TG) dan reverse primer 1184L (GAG CAG TCT AAT GCA CAA AGC). Lipocalin sebagai kontrol internal PCR positif. Primer – primer tersebut di sintesis oleh Bioneer (Daejeon, Korea). Volume dupleks PCR yang digunakan sebanyak 50 μL yang mengandung 2 disk dari FTA card 0.5 μL of a 10 mM dNTP mixture, 0.3 μL of Taq DNA polymerase, 2.5 μL of 10×Taq buffer, and 2 μL of 10 pmol of each primer. Suhu awal untuk denaturasi adalah 95°C selama 5 menit, kemudian digunakan 38 siklus dengan suhu denaturasi 94°C selama 1 menit, suhu annealing 55°C selama 30 detik, dan ekstension pada suhu 72°C selama 1 menit, yang diikuti dengan final ekstension pada suhu 72°C selama 5 menit.

PCR dilakukan terhadap 60 bibit cabai yang rentan terhadap higromisin untuk mengetahui keberadaan pita negatif. Namun, karena tidak ditemukan pita negatif maka dilakukan screening terhadap keseluruhan percobaan. Frekuensi gene flow dihitung sebagai persentase transgene yang terdeteksi per jumlah biji yang dikecambahkan.

 

HASIL DAN DISKUSI

Pada percobaan tahun 2006 didapatkan 13925 benih cabai. Setelah dilakukan higromisin assay dan PCR dihasilkan 20 tanamn hibrida transgenik antara tanaman transgenik dan tanaman non-transgenik (Gambar 3).

Frekuensi gene flow dari tanaman cabai antraknosa resisten ke tanaman kontrol non-transgenik pada tahun 2006 sangat rendah. Hanya dihasilkan 8 hibrida transgenik dari 7071 benih WT512. Frekuensi hibrida transgenik tertinggi dihasilkan dari jarak pertanaman 0.5 m – 5 m disebelah barat blok tanaman transgenik dengan frekuensi tertinggi dihasilkan pada jarak pertanaman 0.5 m. Frekuensi hibrida transgenik dari Manidda juga sangat rendah, yaitu 12 hibrida dari 6854 benih yang dihasilkan. Hibrida – hibrida tersebut dihasilkan hanya sampai jarak pertanaman 18 m disebelah barat dan jarak pertanaman 7 m di sebelah timur dari blok tanaman transgenik tanaman. Persentase hibrida transgenik tertinggi dihasilkan oleh tanaman pada jarak 2.5 m sebelah timur blok anaman transgenik (Tabel 2).

Pada percobaan tahun 2007 dihasilkan benih sebanyak 6913 benih. Dari jumlah tersebut, didapatkan 33 hibrida transgenik dari WT512 dan 50 hibrida transgenik dari CM (gambar 4).

Gene flow dari tanaman transgenik ke WT512 lebih besar dihasilkan dari benih yang diambil pada bulan Agustus dibandingkan dari benih yang diambil pada bulan September (Tabel 3). Frekuensi hibrida transgenik tertinggi yaitu 6.19% dihasilkan dari blok W1 pada bulan Agustus. Hal yang sama juga diperlihatkan oleh tanaman CM. Secara keseluruhan, hibrida transgenik tertinggi dihasilkan pada blok W2 (1,48%) pada tanaman WT512 dan blok C1 (1,82%) pada tanaman CM.

Cabai tergolong sebagai partially self-pollinated, Namun, penyerbukan silang alami pada cabai termasuk tinggi. Penyerbukan silang alami pada cabai dapat mencapai 54.9% (Campodonico, 1983) atau 91% (Tanksley, 1984). Salah satu yang menyebabkan hal itu terjadi adalah adanya aktivitas serangga pollinator. Walaupun demikian, frekuensi gene flow yang terjadi pada percobaan ini masih lebih rendah. Pada percobaan tahun 2006, seluruh gene flow terjadi pada jarak pertanaman 5 m dari tanaman transgenik kecuali 2 hibrida transgenik yang dihasilkan pada jarak 7 m dan 18 m (Tabel 2). Hasil ini sejalan dengan hasil yang dilaporkan oleh Kim (2009) bahwa gene flow dari tanaman cabai tansgenik CMV resisten hanya terjadi pada jarak 5 m dari blok tanaman transgenik.

Jumlah tanaman transegenik yang digunakan dalam percobaan ini telah ditingkatkan dari hanya 40 tanaman pada percobaan 2006 menjadi 342 tanaman pada percobaan tahun 2007. Hal ini menyebabkan frekuensi gene flow lebih tinggi terjadi pada tahun 2007. Pada percobaan tahun 2007 sulit untuk menentukan jarak gene flow. Namun, terlihat bahwa terdapat hibrida transgenik yang dihasilkan dari tanaman nontransgenik pada jarak pertanaman yang dekat dengan tanaman transgenik (Gambar 5), sehingga isolasi jarak sebesar 20 m merupakan jarak yang direkomendasikan untuk pengujian lapang tanaman cabai transgenik Korea.  Jarak isolasi ini sebelumnya hanya terbatas pada percobaan tanaman transgenik di Canada (CIFA, 2000)

Gene flow yang lebih tinggi dihasilkan dari benih yang dipanen pada bulan Agustus 2007 dibandingkan benih dari bulan September 2007. Hal ini mengindikasikan adanya aktivitas pollinator yang lebih tinggi selama bulan Juni, sedangkan buah yang dipanen pada bulan September, polinasinya diduga baru terjadi pada bulan Juli 2007 sehingga frekuensi sene flow nya lebih rendah. Besarnya curah hujan yang terjadi pada bulan tersebut juga mempengaruhi terjadinya gene flow dari cabai transgenik ke cabai non-transgenik. Hal ini dapat terjadi karena angin dan hujan berpengaruh tidak langsung terhadap keberhasilan penyerbukan silang alami pada tanaman cabai (Bosland 1993; Free 1993; Delaplane and Mayer 2000), sehingga kecepatan angin bukan merupakan faktor utama yang mempengaruhi gane flow transgen dari cabai transgenik ke cabai non-transgenik. Bumble bees, honeybees, and thrips diduga merupakan faktor utama yang mempengaruhi terjadinya penyerbukan silang alami pada tanaman cabai (Rabinowitch et al. 1993; Shipp et al. 1994; Saxena et al. 1996). Diantara ketiganya, honeybees dan thrips terdeteksi pada percobaan ini. Namun sayangnya, mereka tidak dapat dihitung dengan pasti walaupun jumlah yang terdeteksi di lapang cukup banyak. Pada percobaan ini dihasilkan frekuensi hibrida transgenik yang lebih tinggi dari tanaman – tanaman kultivar hibrida komersial (manidda dan CM) dibandingkan dari tanaman WT512. Hal ini dapat terjadi karena polen yang berasal dari kultivar – kultivar hibrida tersebut lebih vigor dan baik dibandingkan dengan polen yang berasal dari WT512.

Penelitian ini hanya dilakukan selama dua tahun pada lapangan yang terbatas dan terisolasi. Percobaan pada berbagai tempat lain mungkin akan dapat memberikan informasi yang lebih baik terhadap gene flow tanaman transgenik. Cabai merupakan tanaman menyerbuk sendiri sebagian, walaupun demikian penyerbukan silang alami pada tanaman ini tetap dapat terjadi karena adanya serangga polinator (OECD, 2006). Khusus untuk honeybees yang penyebaranya sangat luas dan hampir sama di wilayah Korea. Fakta memperlihatkan bahwa pada percobaan gene flow single – field pada tanaman cotton (Umbeck et al. 1991), potato (McPartlan and Dale 1994), soybean (Yoshimura et al. 2006), and watermelon (Kim et al. 2008), serangga polinator yang menjadi faktor utama terjadinya gene flow dari tanaman transgenik ke tanaman non transgenik. Hal yang sama juga diperlihatkan dari percobaan gene flow pada percobaan two-field (Llewellyn and Fitt 1996;Kimetal. 2009)

Kesimpulan dari percobaan menunjukan bahwa frekuensi gene flow cabai transgenik antaknosa resisten tidak lebih besar dari frekuensi penyerbukan silang alami yang terjadi diantara kultivar cabai yang non-transgenik. Hal ini dapat terjadi karena adanya escape gene, sehingga pencegahan dengan penggunaan isolasi jarak terbatas dapat digunakan.